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Galilei stammte aus einer Florentiner Patrizierfamilie. Sein Familienzweig hatte den Namen eines bedeutenden Vorfahren angenommen, des Arztes Galileo Bonaiuti (15. Jahrhundert). Galileis Vater Vincenzo war Tuchhändler, Musiker und Musiktheoretiker und hatte als solcher mathematische Kenntnisse und Interessen; er untersuchte den Zusammenhang zwischen Saitenspannung und Tonhöhe und entdeckte dabei die vielleicht erste nichtlineare Beziehung der Physik.
Galileo Galilei wurde als Novize in einem Kloster erzogen und zeigte Neigung, in den Orden einzutreten, wurde aber vom Vater zum Medizin-Studium nach Pisa geschickt (1580). Nach vier Jahren brach er sein Studium ab und ging nach Florenz um bei Ostilio Ricci, einem Gelehrten aus der Schule von Niccolò Tartaglia, Mathematik zu lernen. Er bestritt seinen Lebensunterhalt mit Privatunterricht, beschäftigte sich mit angewandter Mathematik, Mechanik und Hydraulik, und begann in den gebildeten Kreisen der Stadt mit Vorträgen und Manuskripten auf sich aufmerksam zu machen. Vor der Accademia Fiorentina glänzte er mit einem geometrisch-philologischen Referat über die Topographie von Dantes Hölle (Due lezioni all'Accademia fiorentina circa la figura, sito e grandezza dell'Inferno di Dante, 1588). 1585/86 veröffentlichte er erste Ergebnisse zur Schwere fester Körper (Theoremata circa centrum gravitatis solidorum) und löste ein antikes Problem (Heron) durch Konstruktion einer hydrostatischen Waage zur Bestimmung des spezifischen Gewichts (La bilancetta, Manuskript).